大腸桿菌使用方法

　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1菌種的方法有很多，如電轉(zhuǎn)化、化學(xué)轉(zhuǎn)化等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的不同，用的試劑和培養(yǎng)基有所不同。本手冊提供一個電轉(zhuǎn)化方

　　法。

　　挑取酵母單菌落，接種至含有 5 mL YPD 培養(yǎng)基的 50 mL 三角瓶中，30℃，250-300 r/min 培養(yǎng)過夜；

　　取 100-500 μL （≤1:100）的培養(yǎng)物接種至含有 50 mL 新鮮培養(yǎng)基的200 mL 三角搖瓶中，28~30℃，250-300 r/min 培養(yǎng)過夜(約 20 小時)，至 OD600 達(dá)到 1.3~1.5；

　　將細(xì)胞培養(yǎng)物于 4℃，1500g 離心 5 分鐘，用 50 mL 的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；

　　按步驟 3 離心，用 25 mL 的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；

　　按步驟 3 離心，用 2-5 mL，1M 的冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；

　　按步驟 3 離心，用 160 μL 的冰預(yù)冷的 1M 的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為 240 uL；

　　將 5~20 μg 的線性化 DNA 溶解在 5~10 μL TE 溶液中，與 80 μL 的上述步驟 6 所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至 0.2 cm 冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；

　　將電轉(zhuǎn)化杯冰浴 5 分鐘；

　　根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊（推薦：電壓 1.5 kV ；電容 25 μF ；電阻 200 Ω；電擊時間為 4 ～10 msec）。

　　電擊完畢后，馬上加入 1 mL 1M 的冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至 1.5 mL 的 EP 管中，置于 30℃搖床低速培養(yǎng) 1 小時；

　　將菌體懸液涂布于 MD 平板上，每 200~600 μL 涂布一塊平板；

　　將平板置于 30℃倒置培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)（3-4 天）。

　　四、注意事項(xiàng)

　　涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的DNA 總量較多，可取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；若轉(zhuǎn)化的DNA 總量較少，可取200-300μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。若預(yù)計(jì)的克隆數(shù)較少，可通過離心(4,000rpm，2分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于平板中。

　　新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。

　　涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。